Molekul DNA dapat masuk ke dalam sel melalui selaput membran sel. Terdapat tiga cara molekul DNA masuk ke dalam sel, yaitu konjugasi, transformasi dan transfeksi. Transformasi adalah cara yang paling umum digunakan untuk memanipulasi DNA bakteri agar diperoleh sifat yang diinginkan. Namun, proses transformasi tidak dapat dilakukan oleh semua spesies bakteri, hanya terdapat beberapa bakteri seperti Bacillus dan Streptococcus. Pada percobaan ini digunakan bakteri E. coli yang telah dimanipulasi agar dapat menyerap molekul DNA yang berada di lingkungannya. Sel ini disebut dengan sel kompeten. Sel bakteri dapat dibuat menjadi kompeten dengan perlakuan TB (transformation buffer) yang mengandung CaCl2 atau MnCl2 yang merupakan garam. Mekanisme pembuatan sel kompeten belum diketahui secara pasti tetapi pelakuan dengan garam tersebut diduga meningkatkan permeabilitas membran sel dan meningkatkan porositas membran. Hal ini memungkinkan DNA bebas dapat masuk ke dalam sel (Brown 1997).

Transformasi sel kompeten E. coli dengan metode CaCl2 pertama kali diperkenalkan oleh Mandel dan Higa (1970). Metode ini cukup efisien dan tidak membutuhkan alat khusus. Dagert dan Ehrlich (1974) memodifikasi metode ini dengan meningkatkan lama paparan sel terhadap CaCl2. Sementara itu, Kushner (1978) berusaha meningkatkan efisiensinya dengan menggantikan kalsium dengan kation lainnya, sedangkan Hanahan (1983) menambahkan beberapa senyawa lain untuk meningkatkan efisiensinya.

Transformasi DNA ke dalam sel bakteri dilakukan dengan metode kejut panas. Perlakuan ini dimaksudkan untuk membuka pori membran sel dan mengaktifkan protein Hsp (heat shock protein). Suhu yang digunakan untuk proses kejut panas adalah 42oC. Perlakuan heatshock tidak dilakukan terlalu lama yaitu maksimal 90 detik agar sel yang sudah terbuka tidak membuka terus sehingga sel tidak menjadi lisis. Sebelum diberi suhu 42oC sel tersebut diinkubasi dalam es selama 20 menit. Selanjutnya untuk mengetahui DNA insert yang digunakan telah masuk ke dalam sel, maka sel ditumbuhkan dalam media LB padat  yang mengandung ampisilin, LA, xgaL, dan IPTG, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC. Ampisilin yang ditambahkan bertujuan untuk menyeleksi sel transforman karena plasmid yang terinsersi memiliki gen penanda resistensi ampisilin.

Hasil yang didapatkan dari pengamatan adalah terjadi pertumbuhan bakteri baik pada kontrol negatif maupun sampel (Gambar 2 & 3). Secara teori, bakteri yang ditumbuhkan pada cawan kontrol negatif adalah bakteri yang bukan transforman sehingga tidak boleh ada pertumbuhan. Adanya koloni bakteri yang dapat tumbuh menandakan terjadinya kontaminasi bakteri transforman pada cawan kontrol negatif. Sementara pada cawan sampel terjadi pertumbuhan bakteri E.coli transforman yang telah membentuk koloni tunggal. Transformasi antara sel yang kompeten dapat terjadi saat bakteri ditumbuhkan dalam media dan dapat menyebabkan kesalahan pada perhitungan laju transformasi. Hal ini dapat diperbaiki dengan penambahan EDTA pada media seleksi (Brown TA 1997).

Sel E. coli secara alami memiliki kemampuan transformasi yang rendah. Peningkatan kemampuan transformasi secara alami dilakukan dengan memanen sel pada fase stasioner dan penumbuhan kembali pada media. Sel yang kompeten diperoleh pada fase lag dan menghilang pada fase log (eksponensial). Laju transformasi meningkat seiring dengan jumlah plasmid hingga mencapai fase plateau (Tsen et al. 2002).

LacZ akan ditranskripsi secara normal dan dapat membentuk α-complementaion menjadi β-galaktosidase yang dapat memecah X-gal menjadi galaktosa dan turunan indoksil. Turunan tersebut selanjutnya akan dioksidasi sehingga membentuk turunan dibromo-dikloro yang menyebabkan berubahnya warna koloni menjadi biru saat ditumbuhkan pada media agar yang mengandung X-gal. Akan terdapat tambahan gen insert yang ikut ditranskripsi oleh RNA polimerase. Hal tersebut menyebabkan gen lacZ tersebut tidak dapat membentuk enzim β-galaktosidase yang fungsional dan X-gal tidak akan dipecah sehingga koloni yang dihasilkan tetap berwarna putih.

Proses PCR untuk memperbanyak DNA melibatkan serangkaian siklus temperatur yang berulang dan masing-masing siklus terdiri atas tiga tahapan. Tahapan yang pertama adalah denaturasi cetakan DNA (DNA template), yaitu pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal. Sesudah itu, dilakukan penurunan temperatur yang memungkinkan terjadinya penempelan (annealing) atau hibridisasi antara oligonukleotida primer dengan utas tunggal cetakan DNA. Tahap yang terakhir adalah tahap ekstensi atau elongasi (elongation), yaitu pemanjangan primer menjadi suatu utas DNA baru oleh enzim DNA polimerase. Temperatur pada tahap ini bergantung pada jenis DNA polimerase yang digunakan. Pada akhirnya, satu siklus PCR akan menggandakan jumlah molekul cetakan DNA atau DNA target, sebab setiap utas baru yang disintesis akan berperan sebagai cetakan pada siklus selanjutnya.

Hasil PCR divisualisasikan melalui elektroforesis dengan lampu UV. Hasil elektroforesis menunjukan pita-pita DNA hasil PCR. Pita-pita ini menunjukan hasil PCR berhasil dilkukan. Hasil PCR dapat dilihat pada Gambar 6 hasil pengamatan.

Identifikasi patogen dalam daging pada praktukum ini menggunakan sampel daging kambing dan ayam yang digerus hingga halus. Identifikasi patogen ini divisualisasikan dengan hasil running elektroforesis DNA pengkode 16s RNA yang terdapat pada mikroba patogen. Tahapan identifikasi ini yaitu penghancuran daging, lisis sel, presipitasi protein dan pencucian. Buffer lysis yang dengan proteinase K berfungsi untuk mendenaturasi protein. Sedangkan penambahan isopropanol dingin agar proses presipitasi cepat.

Amplifikasi dari identifikasi patogen pada daging sekuen 16 sRNA pada bakteri patogen. 16s rRNA merupakan salah satu penyusun subunit 30S, yang penting untuk translasi, dan terdiri dari 1542 pasangan basa. 16s rRNA adalah suatu jenis RNA yang dilibatkan dalam produksi protein. Di antara berbagai teknik yang digunakan, RNA ribosomal paling banyak digunakan sebagai penanda molekuler. Pada prokaryota terdapat tiga jenis RNA ribosomal, yaitu 5S, 16S, dan 23S rRNA. Di antara ketiganya, 16S rRNA yang paling sering digunakan. Sekuens gen 16S rRNA ini dapat digunakan untuk identifikasi bakteri yang mengalami penyimpangan strain fenotip. Analisis gen penyandi 16S rRNA telah menjadi prosedur baku untuk menentukan hubungan filogenetik dan menganalisis suatu ekosistem. 16S rRNA dapat digunakan sebagai penanda molekuler karena molekul ini bersifat ubikuitus dengan fungsi yang identik pada seluruh organisme.

Setelah elektroforesis gel agarosa, produk individual amplifikasi PCR pada DNA pengkode 16 sRNA berhasil diisolasi, hal ini terlihat adanya endapan pada tabung ependorf meskipun hanya sedikit. Untuk mengujinya dilakukan Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan 3 tahapan yaitu denaturasi, annealing dan extention kemudian divisualisasi dengan elektroforesis. Denaturasi terjadi pada suhu 900 dan heliks ganda DNA akan mengalami disosiasi selama denaturasi. Penempelan primer yang spesifik terjadi pada suhu 600 sedangkan yang tidak spesifik pada suhu 600. Pada proses ini, primer-primer akan berikatan dengan DNA pada tempat yang paling tepat. Pemanjangan terjadi pada suhu 700. dNTP yang ditambahkan berfungsi agar DNA taq polymerase dapat bekerja. Taq-Polymerase memanjangkan (polimerisasi) primer-primer sesuai dengan utas DNA cetakan. PCR akan membuat DNA single strain menjadi double strain (Elrich 1989).

Hasil elektroforesis menunjukan pita-pita DNA pengkode 16s RNA.  Pita-pita ini menunjukan isolasi DNA pengkode 16s RNA berhasil dilakukan. DNA marker yang digunakan yaitu 1 KB. Hal ini berarti daging yang digunakan pada percobaan ini mengandung bakteri patogen.

Mikroba patogen adalah yang sangat menentukan keamanan mikrobiologis produk dan keberadaannya bisa membahayakan kesehatan. Daging merupakan pangan bergizi tinggi, dengan kandungan air sekitar 75%, protein 19%, lemak 2.5%, nitrogen terlarut non protein 1.65% dan bahan-bahan anorganik 0.65%. Ketersediaan nutrisi yang lengkap ini menyebabkan daging menjadi media yang sangat baik bagi pertumbuhan mikroba. Didalam daging segar, jumlah bakteri patogen (penyebab penyakit) jauh lebih kecil dibandingkan dengan jumlah bakteri pembusuk. Tetapi yang perlu diingat juga adalah, bahwa beberapa bakteri patogen dapat menyebabkan penyakit dalam jumlah yang sangat sedikit.

Daging dan produk olahan daging merupakan sumber penting terjadinya infeksi yang disebabkan oleh Salmonella spp., Campylobacter jejuni, Yersinia enterocolitica, E. coli VTEC, Listeria monocytogenes dan juga Clostridium perfringens. Daging juga bisa menyebabkan intoksikasi yang disebabkan oleh Staphylococcus aureus dan Clostridium botulinum. Keberadaan bakteri ini di dalam daging segar bervariasi, dan biasanya tergantung pada berbagai faktor diantaranya jenis organisme, faktor geografis, kondisi peternakan, praktek produksi dan pengolahan daging. Pada tulisan ini akan dibahas tentang keamanan mikrobiologis daging dan produk olahannya.

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolais DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Mader 193). Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell 2002).

Isolasi DNA dengan teknik sentrifugasi akan mengendapkan DNA. Supaya hasil isolasi berupa DNA murni yang tidak tercampur dengan molekul-molekul lain maka dalam proses isolasinya dicampurkan berbagai macam larutan. Larutan A berfungsi sebagai resuspensi yaitu penggabunagn kembali pelet yang telah terbentuk dengan larutan yang dicampurkan. Selain itu larutan A juga berfungsi sebagai buffer dan pengkelat. Pemilihan buffer tersebut dilihat dari kemampuan buffer menghasilhkan arus listrik. Larutan B yang terdiri atas SDS dan NaOH berfungsi sebagai larutan pelisis. NaOH sendiri dapat mendenaturasi protein. Sedangkan larutan C befrungsi untuk merenarutasikan kembali. Etanol 70% yang digunakan dalam proses isolasi berfungsi untuk mengeluarkan endapan garam karena Na+ bermuatan positif dan DNA bermuatan negatif. Larutan ddH2O yang ditambahkan berfungsi agar endapan DNA yang dihasilkan didapat dengan konsentrasi yang cukup tinggi. Larutan di vortex untuk memudahkan bakteri tersuspensi. Bakteri yang telah diendapkan tersebut kana lisis dengan penambahan larutan buffer. Agar proses lisisnya bakteri sempurna maka larutan dibolak-balik secara halus. Bakteri yang telah lisis ini ditandai dengan munculnya lendir. Ciran DNA yang dihasilkan kemudina dipisahkan dari endapannya. Cairan ini ditambahkan RNase untuk melisiskan RNA supaya hasil yang diisolasi berupa DNA murni.

DNA yang telah diisolasi diuji kualitas dan kuantitasnya melalui elektroforesis dan spektrofotometer. Elektroforesis memisahkan DNA, RNA, dan protein berdasarkan bobot molekul dan muatanya dengan menggunakan media pemisah. DNA bermuatan negatif sehingga pada elektroforesis DNA akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan pergerakan ini tergantung pada ukuran molekul DNA, kerapatan media gel yang dilalui DNA, serta arus listrik yang diberikan untuk bermigrasi molekul DNA. Sebelum proses elektroforesis suspensi DNA dicampur dengan peyangga muatan berwarna loading dye. Penambahan warna ini berfungsi untuk menambah densitas sehingga DNA bearada di bagian bawah sumur, selain itu pewarna ini digunakan untuk memudahkan meletakan contoh DNA ke dalam sumur dan bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA.

DNA hasil elektroforesis yang terlihat di atas lampu UV dapat dilihat pergerakannya. Hasil elektroforesis DNA total menunjukkan adanya pita-pita DNA yang diisolasi dari bakteri Escherichia coli yang kemungkinan adalah DNA plasmid (Gambar 1). Hal ini dapat dilihat dari pergerakannya yang tinggi. Pergerakan DNA di agarose berhubungan dengan besar molekul. Sehingga pergerakan yang tinggi ini menunjukan ukuran DNA yang tidak terlalu besar. Plasmid merupakan DNA sirkuler yang ukurannya relatif kecil. Hal ini menunjukkan bahwa DNA total yang diisolasi mempunyai keutuhan yang tinggi. Akan tetapi pada beberapa kelompok pergerakan DNA tiadak dapat diamati. Kejadian ini dapat terjadi karena kesalahan teknis saat memasukan DNA ke dalam sumur gel agarose. Bisa jadi DNA yang dimasukan tidak masuk benar-benar ke dalam sumur gel sehingga saat elektroforesis DNA tidak bergerak. Selain itu kesalahan juga dapat terjadi karena DNA yang telah masuk ke dalam sumur tersedot kembali masuk ke dalam pipet mikro. Sehingga sumur tidak berisi DNA.

Kuantifikasi DNA total dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm menunjukkan bahwa rendemen isolasi DNA konsentrasinya berkisar antara 19610 ng/ µL dan 19800 ng/ µL tiap 1500 µL bahan biakan E. coli. Tingkat kemurnian DNA plasmid yang diisolasi dilihat dari nilai absorban pada panjang gelombang 260 nm dibadi nilai absorban pada panjang gelombang 280 nm. Kemurnian DNA plasmid kelompok 8 menunjukan hasil sebesar 1,115. Nilai ini belim termasuk nilai DNA murni karena isolasi DNA murni nilainya lebih besar atau sama dengan 1,8.